GS-441524 İçeren Çok Bileşenli Oral İlaçla Fip Tedavisi

Daniela Krentz1, Katharina Zenger1, Martin Alberer2, Sandra Felten1, Michele Bergmann1, Roswitha Dorsch1, Kaspar Matiasek3, Laura Kolberg2, Regina Hofmann-Lehmann4, Marina L.Meli4, Andrea M. Spiri4, Jeannie Horak5, Saskia Weber6, Cora M. Holicki6, Martin H. Groschup6,7, Yury Zablotski1, Eveline Lescrinier8, Berthold Koletzko5, Ulrich von Both2,9, Katrin Hartmann1
1 Clinic of Small Animal Medicine, Centre for Clinical Veterinary Medicine, LMU Munich, 80539 Munich, Germany; [email protected] (K.Z.);
2 Division of Paediatric Infectious Diseases, Dr. von Hauner Children’s Hospital, University Hospital, LMU
Munich, 80337 Munich, Germany; [email protected] (M.A.); [email protected] (L.K.); [email protected] (U.v.B.)
3 Section of Clinical and Comparative Neuropathology, Institute of Veterinary Pathology, Centre for Clinical
Veterinary Medicine, LMU Munich, 80539 Munich, Germany; [email protected]
4 Clinical Laboratory, Department of Clinical Diagnostics and Services, and Center for Clinical Studies, Vetsuisse Faculty, University of Zurich, CH-8057 Zurich, Switzerland; [email protected] (R.H.-L.); [email protected] (M.L.M.); [email protected] (A.M.S.)
5 Department Paediatrics, Division Metabolic and Nutritional Medicine, Dr. von Hauner Children’s Hospital,
University Hospital, LMU Munich, 80337 Munich, Germany; [email protected] (J.H.); [email protected] (B.K.)
6 Institute of Novel and Emerging Infectious Diseases, Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald-Insel Riems,
17493 Greifswald, Germany; [email protected] (S.W.); [email protected] (C.M.H.); [email protected] (M.H.G.)
7 German Center for Infection Research (DZIF), Partner Site Hamburg-Luebeck-Borstel-Riems,
Greifswald-Insel Riems, 17493 Greifswald, Germany
8 Medicinal Chemistry, KU Leuven, Rega Institute for Medical Research, 3000 Leuven, Belgium; [email protected]
9 German Center for Infection Research (DZIF), Partner Site Munich, 80337 Munich, Germany
Correspondence: [email protected]
Yazarlar bu çalışmaya eşit katkıda bulunmuştur.
GS-441524 İçeren Çok Bileşenli Oral İlaçla Kedi Enfeksiyöz Peritoniti Olan Kedilerin Tedavisi Özet: Kedi koronavirüsünün (FCoV) yol açtığı kedi enfeksiyöz peritoniti (FIP) kedilerde yaygın rastlanan bir hastalıktır, tedavi edilmediğinde ölümcüldür ve halen yasal olarak etkin bir tedavisi bulunmamaktadır. Bu çalışmanın amacı spontan kedi enfeksiyöz peritonitine sahip kedilerde hayatta kalma oranı, klinik ve laboratuvar parametrelerinin gelişimi, viral yükler, anti-FCoV antikorlar, olumsuz etkiler gözlemlenerek oral tedavi ve aynı zamanda çok bileşenli Xraphconn® in vitro ilacının efikasitesini ve toksitesini değerlendirmektir. Kütle spektrometrisi ve nükleer manyetik rezonans GS-441524’ü Xraphconn®’un etkin bileşeni olarak tanımlamıştır. Kedi enfeksiyöz peritonitisi olan onsekiz kedi 84 gün boyunca oral yolla tedavi edilirken ileriye dönük olarak takip edildi. Her bir muayene günündeki anahtar parametrelerin değerleri doğrusal karışık etki modelleri kullanılan başlangıç tedavisi öncesi değerlerle karşılaştırılmıştır. Xraphconn® hücre kültüründe yüksek virus öldürücü etkinliği göstermiştir. Tüm kediler tedavinin ilk birkaç günü içerisinde ciddi olumsuz etkiler göstermeksizin klinik ve laboratuvar parametrelerde çarpıcı iyileşme ve viral yüklerde büyük çapta azalma ile birlikte iyileşti. GS-441524 içeren Xraphconn’lu oral tedavi, Kedi Enfeksiyöz Peritoniti için ciddi olumsuz etkiler göstermeksizin oldukça etkilidir. Bu ilaç Kedi Enfeksiyöz Peritoniti’nin oral tedavisi muazzam bir seçenek sunmaktadır ve tüm türlerdeki koronavirüsle ilgili diğer ciddi hastalıklar için potansiyel etkili tedavi seçeneği olarak denenmelidir. Anahtar kelimeler: FIP, kedi koronavirüsü; FCoV; tedavi; terapi; antiviral kemoterapi; Xraphconn®; GS-441524; Mutian 1.Giriş Koronavirüsler, çok çeşitli memeli ve kuş konakçılara bulaşan, bazılarında ciddi hastalıklara yol açan RNA virüslerinin büyük bir ailesini içermektedir. Çok çeşitlilikleri hedef hücre tropizmini ve/veya konakçı spektrumunu değiştirebilen yeni koronavirüs varyantlarının sürekli biçimde ortaya çıkmasına neden olur ve türlerarası ya da zoonotik aktarıma yol açar; sonuncusunun son örnekleri Şiddetli Akut Solunum Sendromu Koronavirüsü (SARS-CoV), Ortadoğu Solunum Sendromu Koronavirüsü (MERS-CoV) ve en son Koronavirüs Bulaşıcı Hastalık 2019 (COVID-19)a neden olan Şiddetli Akut Solunum Sendromu Koronavirüsü 2 (SARS-CoV-2). Son zamanlarda ortaya çıkan koronavirüsle ilgili hastalıklar, koronavirüs taşıyan hayvanlara yakın teması olan insanlarda son derece öldürücü koronavirüs enfeksiyonunun potansiyel risklerine dair farkındalık uyandırmaktadır. Dokudaki değişiklikler ya da virülansta değişikliklere neden olan hücre tropizmi koronavirüslerin ayırt edici özellikleridir. Böylesi bir virülans değişikliği için verilebilecek en iyi örnek iki farklı biyotipte meydana gelen kedi koronavirüsüdür (FCoV). Kedilerin yalnızca küçük bir oranına (çoklu kedi ortamlarında %7-14) ölümcül hastalık kedi enfeksiyöz peritonitini harekete geçiren, kedi koronavirüsünün spontan mutasyonuyla tetiklenen, böylelikle bireysel kedilerde monositler/makrofajlar için tropizm kazanan, çoklu kedi nüfusları arasında hayli yaygın olan kedi koronavirüsü bulaşmıştır. Kedi enfeksiyöz peritonitis olan tüm kediler ya ölmektedir ya da etkin bir tedavinin yoksunluğundan dolayı ötenazi uygulanmaktadır. Tedavi edilmemiş kedilerin medyan sağ kalım süresi yalnızca sekiz ila dokuz gündür. Antiviral bileşiklerle önceki yürütülen tedavi deneyleri, hem kedi interferon omega kullanımı gibi sınırlı biçimde efikasite göstermiştir, hem de ribavirin gibi kediler için oldukça toksiklerdi. Avrupa ve Birleşik Devletler gibi çoğu ülkelerde, ruhsatsız bileşikler ihraç edilmesine ve kedi sahipleri tarafından kullanılmasına ragmen Kedi Enfeksiyöz Peritonitisi olan kediler için halen ruhsatı olan etkili tedavi seçeneği bulunmamaktadır. Veterinerlik mesleğine ve veterinerlik ilaçlarına dünya çapında hükmeden yasalardaki farklılık yüzünden Kedi Enfeksiyöz Peritonitinin tedavisi için herhangi ruhsatsız antiviral ajanların kullanımına başlamadan once veterinerlerin yerel yönetmeliklere ve kanunlara dikkat etmesi önemlidir.Bununla birlikte, son zamanlarda bileşiklerin ruhsat almadığı yayınlanmış birkaç çalışma alışılmışın dışında umut verici sonuçlar göstermiştir. Kedi Enfeksiyöz Peritoniti olan kediler için en son umut verici tedavi ön ilaç remdesivirin etkin formu olan GS-441524 nükleosit analogunun kullanımıdır. Bugünlerde, remdesivir yalnızca şiddetli COVID-19 semptomları olan insan hastaları tedavi etmek için koşullu olarak ruhsatlıdır. Bu ileriye dönük çalışmalarda, kediler çeşitli dönem periyodlarında deri altından GS-441524 almıştır ve sahiplerine sosyal medya grupları tarafından benzer şekilde 12 haftalık ya da daha uzun bir periyodda bileşikleri enjekte etmeleri için talimat verilmiştir. Sahipler tarafından uygulanması zor olan böylesi uzun bir periyod üzerine deri altından yapılan enjeksiyonlar, bu ruhsatsız ve denetimsiz preparatların düşük pH değerinden dolayı kediler için oldukça acı verici olabilir ve hatta kedi enjeksiyon bölgesi sarkomları ile ilişkili olabilir. Bundan hareketle, oral bileşikler avantajlı olabilir. Aslında, Mutian (Mutian 200, Nantong, Bioteknoloji, Çin) adı verilen bir preparat Kedi Enfeksiyöz Peritoniti olan (oküler belirtiler gösteren ama efüzyon olmayan) tek bir kedinin başarılı bir tedavi vakası rapor edildi. Mutian 50 gün boyunca her 24 saat oral yoldan uygulanmıştır ve kedi kedi interferon omegası kadar ilave semptomatik tedavi almıştır. Tedavinin birkaç haftası içerisinde, kedi vücut ağırlığında belirgin bir artış ve hematolojik ve biyokimyasal parametreler kadar oküler belirtilerde iyileşme gösterdi. Son geçmişe dönük iki çalışmada, kediler aynı zamanda oral antiviraller yoluyla tedavi edilmiştir. Birinde, geniş çaplı bir online anket, tedavi esnasında destekleyici terapi, potansiyel nüksler ve semptomların iyileşmesi gibi deneyimlerini toplamak için bir antiviral ilaçla Kedi Enfeksiyöz Peritoniti şüphesi taşıyan kedilerini tedavi eden kedi sahiplerine değinmiştir. Geçmişe dönük Çin’de yürütülen bir diğer çalışmada Kedi Enfeksiyöz Peritoniti şüphesi taşıyan 127 kedinin hastalık seyri yakından takip edildi; bunlardan 24 tanesi GS-441524 ile tedavi edilmiştir (uygulama biçimi bahsedilmemiş olmasına ragmen) ve yalnızca bir kedide nüksetmiştir. Yine de, yazarların bilgisine, Kedi Enfeksiyöz Peritoniti olduğundan son derece şüphelenilen ya da doğrulanılan kedilerin antiviral bileşiklerle oral tedavileri üzerine yayınlanmış ileriye yönelik çalışmalar bulunmamaktadır. Kedi Enfeksiyöz Peritoniti gibi ölümcül bir hastalığa sahip kedilerde oral tedavinin efikasitesi istikrarlı bir şekilde ispatlansaydı, bu durum COVID-19 gibi diğer şiddetli koronavirüs-ilişkili hastalıklardaki etkisini inceleyen gelecekteki araştırma için yeni yollar açabilirdi. Buna ek olarak, klinik özelliklerinin benzerliklerinden dolayı, Kedi Enfeksiyöz Peritoniti-kedi modeli, şiddetli sistemiks inflamatuar koronavirüs ile ilişkili sendromlarda potansiyel tedavi yaklaşımları ve patofizyolojik özellikleri aydınlatmak için doğal bir model olarak hizmet edebilir.Bu sebeple, bu çalışmanın amacı, hayatta kalma oranının saptanarak klinik ve laboratuvar parametrelerinin iyileşmesini, viral yüklerinin azaltılmasını, anti-FCoV antikorlarının ölçümünü, ilk olarak in vitro ve daha sonra klinik bir deneyde doğal yolla oluşan Kedi Enfeksiyöz Peritonitinin olduğu kedilerde oral tedavisini, çok bileşenli bir oral ilacın efikasitesini ileriye dönük biçimde değerlendirmektir. Ayrıyeten, potansiyel olumsuz etkiler kaydedilmiştir ve çok bileşenli ilacın içerisindeki aktif maddenin kimyasal yapısı yapısal kimya analizi yöntemleriyle belirlenmiştir. 2. Materyaller ve Yöntemler 2.1. Bileşim Xraphconn® bileşimi kedilerde olduğu kadar in vitro çalışması için de kullanılmıştır. Mutian Life Sciences Limited tarafından 2 parça halinde sunuldu. (Ek Dosya S1). Tablet prospektüsüne gore, aktif madde (ilaç prospektüsünde MT-0901 diye bahsedilen) ayrı ayrı olarak 2.5 mg ya da 10 mg tablet konsantrasyonunda bulunmaktadır. Ilaç prospektüslerine göre diğer bileşim maddeleri, diğer maddelerin yanı sıra, Radix scrophulariae, Platycodon grandiflorum, Phyllostachys pubescens, Forsythia suspense ve Anemarrhena asphodeloides’ti. 2.2. Çok Bileşenli In Vitro İlacın Efikasitesi Xraphconn®'un efikasitesi ilk olarak yerleşik bir hücre kültürü modelinde değerlendirildi. Crandell-Rees Kedi Böbreği (CRFK) hücreleri (Veteriner Hekimlikte Hücre Hatlarının Toplanması CCLV, Friedrich-Loeffler-Enstitüsü, Greifswald-Insel Riems, Germany) yetiştirildi ve %10 fetal buzağı serumu (FCS; Biochrom) ile desteklenmiş Eagle’ın minimal temel ortamında (MEM; Biochrom, Berlin, Germany) korunarak 5% CO2 altında bir atmosferde 37 ± 1◦Cde tutuldu. Yukarıda açıklandığı gibi kedi koronavirüsü RVB-1259 (bir serotip I FCoV suşu) MEM’deki CRFK hücrelerinde bir kez daha çoğaltılmıştır.Hücrelerdeki uygulama için, 2.5 mg aktif madde içeren bir tablet (50 mg) havan kullanılarak ezilip 5 mL MEM ya da dimetil sülfoksit (DMSO) ilave edildi. Süspansiyonlar şırınga filtrasyonu ile temizlendi (Millex-GP şırınga filtresi, gözenek büyüklüğü 0.22 µm). Akabinde, her iki süspansiyon ile logaritmik seyreltme uygulandı (1:10 ila 1:100,000). Özütleştirme veriminin %100 varsayıldığı 50 µg/mL'den 5 ng/mL'ye kadar uzanan bir aktif madde konsantrasyonuna matematiksel olarak karşılık gelir. Hücrelerin filtreden geçirilmiş tablet süspansiyonunun farklı dilüsyonlarına maruz bırakılmasından sonra, bir MTT (3-(4,5 -dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a tetrazole) tahlili (Hücre Çoğalma Kiti; Roche, Basel, İsviçre) kullanılarak hücre canlılık ölçümü uygulanıldı. Kısaca, CRFK hücreleri 96-kuyu plakası üzerinde tohumlandı ve farklı bileşik dilüsyonlar 24 saat sonra ilave edildi. Hücreler sırasıyla 24 veya 48 saat daha kuluçkaya yatırıldı. Akabinde, 10 µL MTT ilave edildi ve bir diğer 24 saat sonra hücreler kuluçkaya yatırıldı. Kuluçka döneminden sonra, çözünürleştirme solüsyonu ilave edildi ve ertesi gün spektrofotometrik olarak enzimatik tepki ölçüldü.Xraphconn® in vitronun efikasitesini değerlendirmek gerekirse, CRFK gecelik hücre kültürleri 0.01’lik çok sayıda enfeksiyonda (MOI) FCoV ile enfektedir. Enfeksiyondan sonra kuyular 60 dakika bir %5 CO2 atmosferin altında 37 ± 1 ◦C’de kuluçkaya yatırıldı ve sonrasında fosfat tamponlu salin ile yıkandı (PBS). Farklı Xraphconn® dilüsyon seviyeleri içeren taze kültür ortamı (%5 FCS takviye edilmiş MEM) ilave edildi. Son olarak, enfeksiyon sonrası 24 ya da 48 saatte süpernatanlar toplandı. Tüm testler dörtlü ölçümler olarak gerçekleştirilmiştir.100 µL yıkama hacminde imalatçının talimatlarına göre, Nucleo-MagVet kit (Macherey-Nagel, Düren, Almanya) kullanılarak süpernatanlardan toplam RNA’nın özütü çıkarılmıştır. Aşağıda belirtildiği gibi, ters transkriptaz polimeraz zinciri tepkisi (RT-PCR) ile kedi koronavirüsü RNA’sı tespit edildi. Yarı maksimum etkili konsantrasyonu (EC50) hesaplamak için; virüs bulaşmış, tedavi edilmemiş hücreler için viral RNA yükü %100'e ayarlandı ve tedavi edilmiş hücreler için elde edilen RNA değerleri bu değere göre normalleştirildi; EC50 değerleri GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, ABD) kullanan doğrusal olmayan bir regresyon analizi tarafından hesaplandı. 2.3. İleriye Yönelik In Vitro Çalışmasının Hastaları Bu çalışma, ileriye yönelik çalışmalar için Alman kılavuzlarına uygun olup Yukarı Baverya Hükümeti (referans numarası 55.2-2532.Vet_02-20-52) ve Münich Ludwig Maximilian Üniversitesi’nin Klinik Veterinerlik Merkezi’nin etik komitesi (referans numarası 261-19-03-2021) tarafından onaylanmıştır. Buna ek olarak, kedi sahipleri aynı zamanda katılmak için yazılı onaylarını vermişlerdir. Başlangıçta 20 kedi çalışmada kaydedildi (Şekil 1). Dahil edilme kriterleri (1) Kedi Enfeksiyöz Peritoniti’nin Teşhisi (2) en az 2 kg vücut ağırlığı (3) kedi immün yetmezlikler virüsü (FIV) ve kedi lösemi virüsü (FeLV) enfeksiyonu için olumsuz test sonuçları (4) diğer ciddi hastalıkların bulunmayışıydı. (1) sunum sırasında koma veya şiddetli ölüm hallerindeyse (oral ilaçların güvenilir bir şekilde emilmesi bu gibi durumlarda beklenemeyeceği için) (2) kedilere tabletleri vermek mümkün değilse, ya da (3) sahipleri kedilerine uygun biçimde ilaçla tedavi verilmesi ya da randevulara katılma konusunda razı değillerse kediler çalışmada hariç tutulmuştur. Kedi Enfeksiyöz Peritoniti bulunan kedilerde tipik olduğu düşünülen klinik ve klinikopatolojik anomalilerle kombinasyon halindeki M1058L ve S1060A spike protein ikamelerine yol açan FCoV spike gen mutasyonlarını hedef alan analiz (IDEXX laboratuvarları, Ludwigsburg, Almanya) ve bir ticari RT-PCR yoluyla ince iğne ile çekilen efüzyondaki, kandaki ya da bir organdaki mutasyon geçirmiş FCoV yapısının tespit edilmesiyle ve/veya değişen organların makrofajları içerisindeki FCoV antigenini tespit eden immünohistokimya yoluyla direkt olarak tespit edilen bir virus olması durumunda bir Kedi Enfeksiyöz Peritoniti teşhisi yapılmıştır (Tablo 1). Bebek baskülü kullanılarak vücut ölçümü yapılmıştır (AE Adam MTB 20 bebek baskülü, Felde, Almanya). Gesellschaft für Versuchstierkunde – Laboratuvar Hayvanları Bilimi Derneğine göre kedilerde kan miktarı numuneliği için verilen yönergelere uygun şekilde ağırlık limiti 2 kg olarak ayarlandı. Kimyasal laboratuvarda ya da bir bakım noktasındaki test ibrazında ya da sevk eden veteriner tarafından anti-FIV antikorları ve FeLV antigeninin varlığı test edilmiştir. Çalışmaya giriş yapılan günde tüm kedilerde karın ultrasonu çekildiği gibi tam bir öykü ya da fiziksel muayene elde edilerek diğer ciddi hastalıkların bulunmadığı saptanmıştır; buna ilaveten, torasik efüzyonu olan kedilerde ekokardiyografi çekildi, nörolojik belirtileri olan kedilerde nörolojik muayeneler yapıldı. Bağırsak paraziti bulaşması, dış kulak iltihabı, rinit, kronik gingivostomatit gibi hafif hastalıkların bulunması hariç tutulmalarına yol açmamıştır (Tablo 1). Çalışmaya dahil edilme sırasında bir kedinin hafif azotemisi vardı (Tablo 1). Bu böbrek değişikliklerinin Kedi Enfeksiyöz Peritonitinden kaynaklandığından şüphelenmek makuldü ve bu sebeple kedi çalışmaya dahil edildi. Çalışmaya başlangıçta kaydedilen 20 kediden 2’si ciddi ölümcül sağlık durumundan dolayı sonradan hariç tutulmuştur (Şekil 1). Böylelikle, 18 kedi son olarak çalışmaya katıldı. Nörolojik/oküler belirtileri bulunması (n = 2) halinde yüksek doz tedaviye (10 mg/kg) ya da nörolojik/oküler belirtileri bulunmadığı (n=16) takdirde düşük doz tedaviye kediler tahsis edilmiştir.18 kedinin yaşları (Tablo 1) 4.7 ve 56.5 aylığa göre (ortalama 7.7 aylık) değişmektedir ve 15 kedi (%83.3) bir yaşından küçüklerdi. Çoğu kedi (11/18; %61.1) European Shorthair (ESH) kedisiydi; diğerleri farklı cinslere aitlerdi. Kedilerin çoğunluğunun erkek olmasıyla birlikte içlerinden 5 tanesi kısırlaştırılmıştı (12/18; %66.6). Dişi kedilerden, 3 tanesi kısırlaştırılmıştı (6/18; %33.3). 2.4. In Vivo Çalışma Tasarımı Kediler Xraphconn®’la 84 gün boyunca oral yoldan tedavi edilmişlerdir (0. günden 83. güne kadar). Bileşiğin dozajı GS-441524 ile ilgili bahsedilen çalışmalara göre seçilmiştir ve tabletin içindeki aktif bileşiğin konsantrasyonundaki tablet prospektüsünde verilen bilgiye dayanmaktadır. Buradan hareketle, kediler nörolojik ve/veya oküler belirtileri yoksa her 24 saatte ağızdan 5 mg/kg aktif bileşikle; nörolojik ve/veya oküler belirtileri varsa her 24 saatte ağızdan 10 mg/kg ile tedavi edilmişlerdir. Xraphconn® tabletleri saptanan kiloya göre günlük olarak ayarlandı ve tabletler her defasında aynı anda aç karnına verildi. Tablet verildikten yarım saat sonra, kedilere yemek verildi. Tablo 1. Çalışmaya katılan kediler, eşkali, evdeki fazladan kedilerin sayısı, kedi enfeksiyöz peritonitinin (FIP) teşhis yöntemi, Kedi Enfeksiyöz Peritonitine ilişkin belirtiler, Xraphconn® tedavi dozu, tedavi süresince başlangıçta ve ilerleyen zamandaki diğer hastalıklar, olumsuz etkiler ve ilave semptomatik terapi.














mg,milligram; kg, kilogram; q24h, her 24 saat; ESH, European shorthair; RT-PCR, ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu; S, spike; BSH, British shorthair; spp., türler. Kedi Enfeksiyöz Peritoniti teşhisi: doğrulanmış Kedi Enfeksiyöz Peritoniti: pozitif IHC artı tutarlı histopatoloji; yüksek olasılıklı Kedi Enfeksiyöz Peritoniti: pozitif RT-PCR ve FCoV spike mutasyonu analizi. 2 son: gözlem süresinin sonuna dek. 3 rehidrasyon ve bakım ihtiyaçları ile hesaplanan bireysel bir dozajda dehidrasyon için 20 mval/L'de potasyum takviyesi ile birlikte Ringer laktat ile sıvı tedavisi. tek bir enjeksiyon olarak ateş tedavisi için (vücut ısısı > 40.5 ◦C) damardan (IV) 4metamizole 30mg/kg.5 antibiyotikler (örneğin,amoxicillin klavulanik asit 20mg/kg her 8 saatte damardan (IV) ya da ağızdan trimethoprim sulfadiazine 20 mg/kg her 12 saatte damardan (IV) ya da ağızdan; marbofloxacin 2 mg/kg her 24 saatte damardan (IV); ; pradofloxacin 6 mg/kg her 24 saatte ağızdan; ampicillin 12.5 mg/kg ikincil şüpheli veya kanıtlanmış bakteriyel enfeksiyonun tedavisi için her 8 saatte damardan (IV) (sola kayma ile nötrofili veya sürekli yüksek vücut ısısı). 6buprenorfin 0.01 mg/kg her 8 saatte damardan (IV) ağrı tedavisi için. maropitant 1 mg/kg kusma ve anoreksiya gibi gastrointestinal belirtilerin tedavisi için her 24 saatte damardan (IV). 8mirtazapine merhemi her 24 saatte iştah açılması için. 9silymarin 20 mg/kg 10 gün boyunca her 12 saatte ağızdan ve sonrasında 20 mg/kg yüksek akciğer enzimlerinin tedavisi için her 24 saatte ağızdan. büyük ölçüde torasik efüzyona sahip kedilerde nefes darlığı oluşması halinde destek olması için oksijen kafesi 11pregabalin 2 mg/kg buprenorfin ağrıyı control etmede yetersiz kaldığında her 12 saatte ağızdan. 12 meloxicam 0.1 mg/kg 1 gün boyunca her 24 saatte ağızdan ve sonrasında 0.05 mg/kg her 24 saatte ortopedik ağrıyı tedavi etmek için ağızdan.
Tüm kediler ilk 8 gün boyunca hastaneye yatırılmıştır (0. günden 7. güne kadar). Bu süre boyunca, kediler günde 24 saat boyunca dahiliye ve yoğun bakımda kurul onaylı uzmanlar tarafından yoğun gözetim ve tıbbi bakım altındaydı ve tüm teşhis prosedürleri, destekleyici önlemler, semptomatik tedaviler gerektiğinde uygulandı (Tablo 1). 0. günde, Xraphconn® ile tedavi öncesinde, her kedide hematolojik ve klinik kimya parametrelerinin yanı sıra bir öykü ve tam fiziksel muayene elde edildi. İlk 8 gün boyunca ve tedavi süresinin geri kalanında birçok zaman noktalarında muhtelif parametreler değerlendirilmeye alınmıştır (Tablo S1). Buna fizik muayene (modifiye edilmiş Karnofsky skorunun saptaması ve vücut ağırlığının ölçümü dahil olmakla)(Tablo S2)(0., 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7.,14., 28., 56.,83. gün), karın ultrasonu (0., 4., 7., 14., 28., 56., 83. gün), hematolojik ve klinik kimya (simetrik dimetilarginin (SDMA) ve serum amiloid A (SAA)) (0., 2., 4., 7., 14., 28., 56., 83. gün) ve kan viral yükünün ölçümü (0., 2., 4., 7., 14., 28., 56., 83. gün), efüzyon viral yükü (drenaj için erişilebilir efüzyon durumunda) ve serum anti-FCoV antikorlar (0., 7., 14., 28., 56., 83. gün) dahildir. Kedilerin abdominal ya da torasik efüzyonları olduğu sürece, karın ve göğüs ultrasonu ve mümkün oldukça abdominosentez veya torakosentez, ayrı ayrı günlük olarak uygulandı ve viral yükün belirlenmesi için sıvı depolandı. Hartmann ve Kuffer tarafından (1998) kediler için modifiye edilen Karnofsky skoru %0’dan (ölü) %50’ye (normal sağlık kondisyonu) kadar bir sınıflandırma kullanan kedilerin sağlık durumu ve genel kondisyonunu değerlendirmek için kullanıldı (Tablo 2). Otomatik bir analizör kullanılarak hematoloji uygulandı (Cell-Dyn 3500, Abott Laboratuvarları, IL, ABD). Hematoloji parametreleri anormal olduğunda Haema Hızlı Boyama/Diff-Hızlı Boyama’ya maruz bırakılan kan yaymaları üzerinde ilaveten manüel olarak diferansiyel kan sayımı yapıldı. Serum biyokimya parametreleri otomatik bir analizörle ölçüldü (Hitachi 911, Roche, Grenzach-Wylen, Almanya), yüksek verimli bir immünoassay kullanılarak IDEXX Diavet AG’de (Bäch, İsviçre) SDMA analiz edildi ve bir cobas® c 501 klinik kimya analizörü (Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, İsviçre) üzerinde lateks aglütinasyon türbidimetrik immünoassay reaksiyonu kullanılarak SAA saptandı (LZ Test SAA, Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japonya).Kediler yedinci günde (klinik durum uzun süreli yatılı tedavi gerektirmedikçe) taburcu edildi ve sahipler ilaç çalışmasını günlük olarak uygulamaya devam etti. Sahipler tabletlerin nasıl verileceğine dair videolar içeren kişiselleştirilmiş talimatlar aldı. Sorunların olması halinde her zaman telefonla yardım isteyebileceklerine ilişkin talimatlar aldılar. Geri kalan sürede, sahipler kedilerini evlerinde yakından gözlemlemek ve takım çalışmasıyla yakın temas halinde kalmak zorunda kaldılar. Tedavi süresi boyunca kedilerin açık olanda olmasına müsaade edilmedi. Bununla birlikte, 17/18 kedi yakın temasla aynı evdeki 1 ve 9 partnerli kedilerin arasındaydı (çoğunun dışarı çıkmasına müsaade edildi)(Tablo 1). Sahipler her seferinde optimal ilaç dozunu garantilemek adına kedilerinin klinik parametreleri ve vücut ağırlığını kaydetmek için günlük tutmak zorunda kaldılar. 2.5. Kanda ve Efüzyonda FCoV Viral Yükü Kedi koronavirüsü RNA yükü kan ve efüzyon örneklerinde birkaç günde tespit edildi (mevcut olduğu sürece). Örnekler 80◦C’de depolandı ve kantitatif RT-PCR (RT-qPCR) tarafından toplu biçimde analiz edildi. Viral toplam nükleik asitler (TNA), 100 µL’lik elüzyon miktarı ile imalatçılarının talimatlarına göre MagNa Pure 96 (Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, İsviçre) ve MagNa Pure 96 DNA ve Viral NA SV Kiti (Roche Diagnostics AG, Risch-Rotkreuz, İsviçre) kullanılarak tüm kandan antikoagüle edilmiş 100 µL ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ya da 200 µL of efüzyondan özütlenerek çıkartılmıştır. Bütün örnekler için, viral nükleik asit (NA) plazma eksternal liziz SV 4.0 protokolü uygulandı. Her bir özüt parçası için, çapraz bulaşmanın kontrolüne paralel olarak negatif kontroller sürdürüldü.Daha önceden yayınlanan bir RT-qPCR tahlili FCoV 7b genini tespit etmek için kullanılmıştır. Yöntemler aşağıdaki gibi uyarlanmıştır: primer ve problar AgPath-IDTM One-step RT-PCR kiti ile kullanılmıştır (Uygulanan Biyosistemler, Rotkreuz, İsviçre). Mastermix 1X RT-PCR tamponu, 1.0 µL Array Script ters transkriptaz ve AmpliTaq Gold DNA polimeraz, 300 nM ileri primer (FCoV2), 900 nM ters primer (FCoV1), 300 nM prob (FCoVp),nükleaz içermeyen H2O, 20 µL’lik son miktara ilave edilmiştir. 25 µL’lik son miktarda 5 µL’lik TNA ile tüm RT-qPCR tahlilleri yürütülmüştür. Pozitif ve negative kontroller ABI 7500 Fast cihazı kullanılmasıyla paralel olarak yürütülmüştür (Uygulanan Biyosistemler). Tüm numuneler inhibisyon olmaması için test edilmiştir. Bir FCoV RNA standardı eğri viral RNA kopya numarasını belirlemek için paralel olarak kullanıldı. 2.6. Anti-FCoV Antikorları FCoV’ye karşı antikorlar 0., 7., 14., 28., 56., 83. Günde ölçüldü. Serum numuneleri −80 ◦C’de depolandı daha önceden bahsedildiği gibi dolaylı bir immünofloresan tahlili (IFA) tarafından analiz edildi. Kısaca, kedi numuneleri 1:25, 1:100, 1:400, 1:1600 ve 1:6400 dilüzyonlarda test edildi. Floresein izotiyosiyanat (FITC) konjuge ikincil antikor (tavşan anti kedi IgG (H+L)(Nordic-MUbio, Sustern, Hollanda; LuBio Sience GmBH, Luzern, İsviçre) 1:40 oranında dilüe edildi. Slaytlar bulaşıcı gastroenterit virüsü (TGEV, Purdue suşu) ile enfekte domuz böbrek hücreleri (PD-5 hücre) kullanılarak hazırlandı. Daha önceden bahsedildiği gibi RT-qPCR ve qPCR tarafından kontamine edici virüslerin olmaması için antijen preparatları test edildi. Her bir slayt ile bir pozitif kontrol (FCoV-antikor-pozitif alan kedisinin alikot serumu örneği) ve bir negative kontrol (spesifik bir patojen içermeyen antikor-negatif kedinin alikotlanmış serumu) yürütüldü. 2.7. Xraphconn®’daki Aktif Maddenin Tanımlandırılması Aktif maddenin tanımlandırılması kütle spektrometrisi (MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) ile gerçekleştirilmiştir. Bu analizlerle ilgili ayrıntılar için, destekleyici bilgiler kısmına bakın (Ek Metin S1). 2.8. Verilerin Analizi Veriler R istatistiksel dili kullanılarak analiz edildi (versiyon 4.0.3; R Core Team, 2020). Tek bir hayvan için birden fazla günde tekrarlanan ölçümler nedeniyle, tüm değişkenler rastgele bir etki olarak tek bir hayvan ile doğrusal karışık efekt modelleri kullanılarak değerlendirildi. Aşağıdaki model varsayımları her zaman kontrol edildi: (1) artıkların normalliği Shapiro-Wilk normallik testi ile değerlendirildi, (2) varyansların homojenliği Levene testi ile değerlendirildi, (3) değişen varyans (hata varyansının sabitliği) Breusch-Pagan testi ile değerlendirildi. Varsayımların ihlal edilmesi durumunda, sağlam bir doğrusal karma etkiler regresyonu (RLMER) uygulandı; RLMER ağırlıklı tahminleri Tasarıma Uyarlanabilir Ölçek yaklaşımı ile hesaplar ve böylelikle, heteroskedastik ve normal olmayan dağınık artıkları daha düşük ağırlıkları aykırı değerlere ve diğer kontaminasyonlara tayin ederek çözer. Tüm belirli günler arasındaki karşıtlıklar (farklar), çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni p-değeri düzeltmesi ile tahmin edilen en küçük kareler marjinal ortalamalarla modele uydurulduktan sonra değerlendirilmiştir. Her gün efüzyonu olan kedilerin sayısını karşılaştırmak için, ikili Fisher testleri aynı zamanda çoklu test için kullanılan Bonferroni p-değeri ayarlaması ile birlikte uygulanmıştır. P değeri ≤ 0.05 olan sonuçlar istatistiksel olarak önemli kabul edilmiştir. Parametrik olmayan normalliği varsaymayan değiştirmeleri olan bootstrap, kan ve efüzyon viral yüklerinin %95 güven sınırları ve araçları elde etmek ve görselleştirmek için kullanıldı. 3. Sonuçlar
3.1. Çok Bileşenli İlacın In Vitro Efikasitesi MEM’de ya da DMSO’da çözünen çok bileşenli Xraphconn® ilacının sitotoksik etkisi MTT tahlilini kullanan CRFK hücreleri üzerinde incelenmiştir. 24 ve 48 saatlik tedaviden sonra, Xraphconn® solüsyonu uygulanan çözücüden bağımsız 1:100 dilüzyonda önemli bir sitotoksite sergilemedi. Dolayısıyla, Xraphconn® 1:100’deki MEM’de çözülebildi ve antiviral efikasite testi için ardışık günlük dilüzyonlar kullanıldı. Bu amaç doğrultusunda, Xraphconn®’la tedavi edilmiş ve tedavi edilmemiş CRFK hücrelerinde FCoV (0.01 MOI) replikasyonu RT-qPCR’la ölçülmüştür ve tedavi edilmeyen kontrollerle karşılaştırıldığında tedavi edilen hücrelerde viral RNA seviyeleri büyük ölçüde azaldığı için Xraphconn®’la FCoV replikasyon inhibisyonu (konsantrasyon 1:100) önemliydi. Bu dilüzyon solüsyondaki aktif maddenin 5 µg/mL’lık bir konsantrasyonuna tekabül etmektedir.FCoV bulaşmış CRFK hücreleri için, Xraphconn® solüsyonunun hesaplanan EC50 değeri 1.65 µg/mL idi (Şekil 2).

Şekil 2. Xraphconn®’un kedi koronavirüsü (FCoV) replikasyon inhibisyonu. (A) Belirtilen aktif bileşik konsantrasyonlarla tedavi edilen enfekte Crandell-Rees Kedi Böbrek (CRFK) hücrelerinden (enfeksiyon çokluğu (MOI=0.01) toplanan süpernatanlardaki FCoV döngü eşiği (ct) değerleri enfeksiyondan 24 saat sonra toplandı (n = 4). Tedavi edilmeyen hücrelerin sonuçları ile karşılaştırıldığında önem seviyeleri Bonferroni’nin çoklu karşılaştırma testi ile tespit edilmiştir ve aşağıdaki gibi belirtilmiştir:*, p ≤ 0.05; ****, p < 0.0001. (B)Dört biyolojik kopyadan elde edilen veriler doğrusal olmayan regresyon analizi ile yarı maksimal etkili konsantrasyon (EC50)değerini hesaplamak için kullanıldı. 3.2. Kedi Enfeksiyöz Peritoniti olan Kedilerde Çok Bileşenli İlacın Efikasitesi 18 kedinin hepsi 84 günlük tedavinin içerisinde klinik olarak tamamen iyileşmiştir ve çalışmanın yayınlanması sırasında (tedavi programını sonlandıran son kediden 99 gün sonra) tüm kediler hala hayattaydı. Sadece bir istisna dışında, tedavi periyodunun sonunda tüm kediler sağlıklı ve asemptomatikti. Çalışmanın yayınlaşması sırasında olduğu gibi tedavinin sonunda da herhangi bir klinik belirti gösteren tek kedi çalışmaya dahil edilirkenki zamanda renal azotemisi bulunan kediydi (3. kedi). Bu kedinin Kedi Enfeksiyöz Peritonitine dair olan tüm diğer belirtileri klinik olarak iyileşti, ancak tedavinin 21. gününde ilk olarak gözlemlenen tek taraflı renal mineralizasyon oluştu. Renal azotemi sıvı tedavisi ile düzeldi ve genel olarak tedavi süresince sabit kaldı. Tedavinin bitiminden üç ay sonra, 168. günde, kedi Kedi Enfeksiyöz Peritoniti ile bir ilgisi bulunmayan ve tıkanıklığa büyük olasılıkla ikincil olarak yol açan hidronefroz ve hafif asit ile tek taraflı idrar yolu tıkanıklığı geliştirmişti.Bütün tedavi edilen kedilerde, tedavi süresince sürekli ve önemli biçimde klinik ve laboratuvar parametreleri iyileşti (Şekiller 3, Şekil 4, Şekil 5 ve S1). 18 kediden 17 tanesi modifiye edilmiş Karnofsky skorunun %45’i ile ilk 7. günden sonra hastaneden taburcu edilmiştir (%50 tamamiyle sağlıklı olarak denk gelebilecek şekilde)(Şekil 3A); bir kedi piyotoraks geliştirmesinden dolayı 11 gün hastanede yatırılmak zorunda kaldı. Tüm kediler hızlı bir şekilde kilo aldı (Şekil 3B) ve tedaviye başlanmasından çok kısa bir süre sonra normal vücut ısısına sahip oldu (Şekil 3C) ve halen efüzyonu olan kedilerin sayısı olduğu gibi (Şekil S1) kedilerin efüzyon miktarı önemli derecede azaldı (Şekil 3D). Buna ilaveten, 0. günle (tedavi öncesi) karşılaştırıldığında 1. günden 28. güne kadar olan parametrelerdeki önemli farklılıklar ile tüm klinikopatolojik parametreler (SAA içeren hematolojik ve klinik kimya parametreleri) istikrarlı bir şekilde iyileşti (Şekil 4A-H). Dikkat çekecek derecede, kedilerin çoğunda (15/18) tedavi öncesinde viral RNA keşfedilebilirdi, fakat tedaviye başlanmasından sonra ikinci günden dördüncü güne kadar bütün kedilerde kan viral yükleri geniş ölçüde azaldı (Şekiller 5A ve 6A). Bütün kedilerin saptanabilir viremiyi temizlediği belirtilirken, 14. güne kadar kedilerin kanında viral RNA bulunmadı (Şekil 5A ve 6A). Çalışmanın başlangıcında, tüm erişilebilir efüzyonlar RT-qPCR-pozitif test edildi (Şekil 5B ve 6B). Daha sonra, viral RNA üç efüzyon örneği hariç hepsinde saptanılabilirdi (Şekil 5B). Bununla birlikte, bu üç kedi RT-qPCRla toplanılarak değerlendirilmiş daha küçük miktarlarda efüzyona sahipti. Çalışmanın başlangıcında bütün kedilerin serum anti-FCoV antikorları vardı, çoğunun yüksek antikor titreleri vardı (14/18 with titers ≥1:1600). Tedavinin başlangıcında 28. gün kadar erken başlayan bazı kedilerde, 14/18 kedide anti-FCoV antikor titreleri azaldı (Şekil 5C ve S2). Kedilerin hiçbirinde bir antikor titresi artışı gözlemlenmemiştir. 3.3. Çok Bileşenli İlacın Kedilerde Yan Etkileri Xraphconn® tedavisi süresince hiçbir ciddi yan etki gözlemlenmemiştir (Tablo 2) ve bu sebeple hiçbir kedide tedavi durdurulmak zorunda kalınmadı. Xraphconn® tedavisinin son gününde (83. gün) bir kedide hafif Heinz vücut anemisi gözlemlendi (Heinz cisimcikleri, %32.5 hematokrit içeren %19.8 kırmızı kan hücrelerine sahip (referans aralığı: %33-44). Kedi S-adenosyl-methionine ile tedavi edildi (Tablo 1) ve hematokrik normal haline getirildi (100. günde %34.7’ye kadar) ve Heinz cisimcikleri azaltıldı (126. günde %8.8’e kadar). 14/18 kedide (%77.7) lenfositoz görüldü; tedaviye başlamadan evvel lenfositoz bunların üçünde zaten orta dereceli olmak üzere ve ikisinde ciddi ölçüde vardı (Tablo 2). Kedilerin çoğunda, bununla beraber, lenfositoz sadece hafif ila orta derecedeydi. Ancak bir kedi (tedavi öncesinde referans aralığının alt kısmında sayılan (1.1 x 109/L) kedi 83. günde büyük ölçüde lenfositoz geliştirdi (40.7 x 109/L). Kan yaymasının sitolojisi ağırlıklı olarak büyük sayıda küçük lenfositler,koyu mavi sitoplazması bulunan izole büyük ya da reaktif lenfositler ortaya çıkardı. Kronik lenfositik lösemiyi bertaraf etmek için reaktif lenfoid hücre nüfusuyla tutarlı olan bir PCR, Antijen Reseptör Yeniden Düzenlemeleri (PARR) uygulanıyordu. Kedilerin çoğu (11/18; %61.1) tedavi periyodu süresince eozinofili geliştirdiler, fakat tüm kedilerde bu durum hafif ölçüdeydi (˂2.0 x 109 /L). Parazit istilasını dışarıda bırakmak için eozinofilisi olan 10/11 kedilerde dışkı incelemeleri uygulandı. Xraphconn® tedavisinin başlangıcından önce, bir kedide Giardia spp. enfeksiyonu bulundu ve kedi fenbendazol ile tedavi edildi; bir başka kedide 56. günde dışkı incelemesiyle Giardia spp. enfeksiyonu tespit edildi (bu kedinin eozinofilisi yoktu; partner kedisinde Giarda spp. enfeksiyonu bulunduğu için dışkı incelemesi yapıldı). 2. gün ile 83. gün aralığında 11/18 kedide karaciğer enzim aktivitesinde bir artış görüldü ama çoğunlukla sadece hafif ila orta derecedeydi. 7/18 kedide (38.9) bir alanine aminotransferaz aktivitesinde (ALT) artış gözlemlendi; bunlardan iki kedi şiddetli ALT aktivitesi artışına sahipti ve silymarin ile tedavi edildiler. 8/18 kedide alkalin fotofatazda bir artış görüldü, ama yalnızca hafif (7 kedi) ila orta derecedeydi (bir kedi). Renal toksisite bulunmadı. Bir istisna dışında, tüm tedavi süresi boyunca SDMA referans aralığında kaldı. kreatinin, üre ve SDMA artışı tedaviye başlamadan evvel bulunan bir kedinin önceden renal azotemisi vardı. Kedilerin hiçbirinde 48 saat içerisinde azotemik olmayan aralıkta 26.4 µmol/L’den fazla kreatininde bir artış veya azotemia ortaya çıkmadı ve kedilerin hiçbirinde oliguri (idrar azlığı) ortaya çıkmadı ve böylelikle akut renal toksisitesine dair hiçbir delil bulunmamaktaydı (47). Hafif prerenal azotemi (izole edilmiş 11,6–12,7 mmol/L arasında üre konsantrasyonu yükselmesi ile) dört kedide tespit edildi ama bu kedilere kan örneği alınmadan evvel aç bırakılmadı. 3.4. Çok Bileşenli İlaçta Ana Aktif Maddenin Tanımlandırılması Xraphconn®'daki aktif bileşenin yapısının Ultra-Yüksek Performans - Sıvı Kromatografisi Elektro-Sprey QTRAP Kütle Spektrometrisi (UHPLCESI-QTRAP-MS/MS) ile Bilgiye Bağlı Çoklu Reaksiyon İzleme ve Edinme ve Gelişmiş Ürün İyon Taraması (MRM-IDA-EPI taraması) kullanılarak değerlendirilmesi GS-441524 ile uygulanan bir kontrol ölçümüne pratikte benzer bir parçalanma modeli sağladı (Şekil 7). LC-MS/MS, iki bileşiğin çok benzer MS-parçalanma örnekleri sunabildikleri çarpışma kaynaklı bozunma (CID) sırasında açılan bir halkayı, GS-441524'ün bir furanoz halkasını ve bir piranoz halkasını ayırt edemezken daha fazla yapı açıklaması sadece NMR spektroskopisi ile gerçekleştirilebilir.


Şekil 3. Çalışma programı boyunca klinik parametrelerin iyileşmesini gösteren zaman çizelgesi. Şekiller ortalama tahmini değerleri ve her bir parametrenin %95 güven aralıklarını göstermektedir. Gri gölgelendirmeler parametrelerin referans aralıklarına işaret etmektedir. Kırmızı yıldız imleri, sağlam doğrusal olmayan karışık etkili modellerle ve doğrusal karışık etkili modelin (ısı için) ölçülerek 0. gün (tedavi öncesi) ile karşılaştırıldığında tedavinin farklı günlerindeki parametrelerin (p ≤ 0.05) önemli farkını göstermektedir. (A) Karnofsky’nin kediler için modifiye skoru. (B) Vücut ağırlığı. (C) Vücut ısısı. (D) Abdominal/torasik ultrason ve parasentez süresince öznel olarak değerlendirilen efüzyon miktarı (0 puandan (sıvı yokken) 4’e kadar (büyük ölçüde efüzyon değeri).








Şekil 4. Çalışma programı boyunca klinikopatolojik parametrelerin iyileşmesini gösteren zaman çizelgesi. Şekiller ortalama tahmini değerleri göstermektedir ve her bir parametrenin %95 güven aralıklarını göstermektedir. Gri gölgelendirmeler parametrelerin referans aralıklarına işaret etmektedir. Kırmızı yıldız imleri, sağlam doğrusal olmayan karışık etkili modellerle ve doğrusal karışık etkili modelin (ısı için) ölçülerek 0. gün (tedavi öncesi) ile karşılaştırıldığında tedavinin farklı günlerindeki parametrelerin (p ≤ 0.05) önemli farkını göstermektedir. (A) Hematokrit. (B) Lenfosit değeri. (C) Bilirubin konsantrasyonu. (D) Toplam protein konsantrasyonu. (E) Albumin konsantrasyonu. (F) Globulin konsantrasyonu. (G) Albumin/globulin oranı. (H) Serum amyloid A (SAA) konsantrasyonu.

Şekil 5. Kandaki kedi koronavirüsü (FCoV) viral RNA yükleri ve efüzyon örnekleri ve serum anti-FCoV antikor titre ölçümleri. (A) EDTA antikoagüle kandaki FCoV RNA yükleri. (B) Efüzyonlardaki FCoV RNA yükleri. (C) Serum anti-FCoV titreler. FCoV RNA yükleri, kantitatif ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu ile belirlendi (RT-qPCR) (A,B). Antikor titreleri dolaylı yoldan immünoflorans tahlili ile saptanmıştır (IFA). NT, test edilmemiştir.

Şekil 6. Çalışma programı süresince kandaki ve efüzyondaki viral yük. Şekiller parametrik olmayan önyüklemeleri kullanan verilerin görselleştirilmesini göstermektedir. (A) EDTA antikoagüle kandaki FCoV RNA yükler.

Tablo 2. Xraphconn® tedavisinin yan etkileri, yan etkilerin puanları, ilk ortaya çıkma günü ve söz konusu semptomatik tedavi. Heinz cisimcikleri oluşumu: hafif (kırmızı kan hücrelerinde %5-9.9’u), şiddetli (kırmızı kan hücrelerinde >%25’i); lenfositoz: hafif (4-7.9 x 109/L), orta derece (8-15 x 109/L), şiddetli e (>15 × 109/L) 3 0. günde önceden bulunmaktaydı: lenfositoz: 5/14 kedi eozinofili: 1/11 4 eozinofili: hafif (0.6–1.9 × 109/L), orta derece (2–10 × 109/L), şiddetli (>10 × 109/L); 5 yüksek akciğer enzimleri: yüksek alanin aminotransferaz (ALT) aktivitesi: hafif (ALT < 200 IU/L), orta derece (ALT 200–350 IU/L), şiddetli (ALT >350 IU/L); yüksek alkalin fosfataz (AP): hafif (AP < 200 IU/L), orta derece (AP 200–350 IU/L), şiddetli (AP > 350 IU/L).
Şekil 7. GS-441524’ün Ultra-Yüksek-Performans-Sıvı Kromatografisi Elektro-Sprey QTRAP Kütle Spektrometrisi (UHPLC-ESI-QTRAP-MS/MS) spektrumları ve tabletten özütlenerek çıkartılan Xraphconn® aktif bileşeninin karşılaştırılması. Her iki test solüsyonundaki bileşikler sadece [M + H]+ m/z 292.1040 ile izobarik olmakla kalmayıp aynı zamanda da özdeş parçalanma spektrumlarını da sergilemişlerdi. Bilgiye Bağlı Veri Toplama ile Çoklu Reaksiyon İzleme ve Gelişmiş Ürün İyonu (MRM-IDA-EPI) ile tarama modu kullanılarak pozitif iyonizasyonla 50 eV’lik bir çarpışma enerjisinde kütle spektrumları üretildi. Cps, her saniye sayar. NMR’de, 2D bir korelasyonlu spektroskopi (2D-COSY) spektrumundan yola çıkılarak,numunedeki tüm değiştirilemez protonlar ve ana bileşenin değiştirilebilir hidroksil protonları belirlenebilir. Gözlemlenen HO-5’(her iki H-5’ protonlarına COSY çapraz tepe noktaları ile) ve HO-4’ün bulunmayışı piranoz halkalarında bu durumun tam tersi bir durum olması beklenirken füranoz halkasının karakteristik özelliğidir. Heteronükleer Tek Kuantum Tutarlılığı (HSQC) spektrumu [49], proton-karbon kimyasal bağı üzerinde J-kaplin etkileşiminden yararlanılarak moleküldeki CH2 ve CH grupları için karbon sinyallerinin belirlenmesini sağlamıştır. Heteronükleer Çoklu Bağ Korelasyonu (HMBC) spektrumunda karbonlar ve protonlar arasındaki 3 bağlı J-kaplin etkileşimi ile Kuvaterner karbonlar belirlenmiştir [50]. Bu HMBC spektrumundaki CN’ye olan H-2’nin çapraz tepe noktaları, moleküldeki siyano grubunun konumunun açık bir şekilde saptanmasına olanak sağladı. Elde edilen 3C kimyasal değişimler ve 1H sinyallerinin modelleri (Tablo S3) GS-441524 hakkındaki raporla örtüşmektedir [51]. 1H kimyasal değişimlerdeki farklılıklar, tuzlar ve diğer katışkılar içeren bir DMSO-d6/D20 karışımında Xraphconn® özüt çıktısı ile ilgili olan tamamen dötoryumlanmış dimetil sülfoksit (DMSO-d6) saf GS-441524 için farklı örnek koşullarıyla ilişkilendirilebilir. Şekil 8. Analiz edilen örneğin 13C spektrumu. Işaretler yukarıda resmedilen Xraphconn® aktif bileşeninindeki karbonların belirlenmesini göstermektedir. 100 ppm’nin üzerindeki tüm sinyaller tanımlanmış bileşikteki siyano-grup ve nükleobaza aittir. Tanımlanmamış katışkıların bazı ek sinyalleri 80 ppm’nin altında gözlemlendi (* ile gösterildi). Ppm, milyon başına parçalar. 4. Tartışma Bölümü Bu ilk Kedi Enfeksiyöz Peritonitine sahip kediler alanında bir oral antiviral bileşeni kullanılan ileriye yönelik kontrollü tedavi denemesinde –çarpıcı bir efikasite gösteren Xraphconn® içeren GS441524 ile oral yoldan yapılan tedavi açıklıkla gösterilebilmektedir. Tedavi edilen 18 kedi tekrar nüksetmeyen ve tamamen iyileşmeye yol açan klinik ve klinikopatolojik parametrelerin hızlı iyileşmesi ile tedaviye çok çabuk yanıt göstermişlerdir. Tedavi olmaksızın, neredeyse Kedi Enfeksiyöz Peritonitinden ölen tüm kediler, Kedi Enfeksiyöz Peritonitini kedi popülasyonunda en ölümcül tanılardan biri haline getirirken, buna karşılık, bu çalışmadaki 18 kedi için hayatta kalma oranı çalışmanın yayınlandığı zaman %100’dü. Ayrıca, tedaviye başladıktan sonra kısa bir sure periyodu içerisinde kan ve efüzyonun (RT-qPCR için mevcut ve hazır bulunan) her ikisindeki viral yükler azalmıştır ve tedaviye muazzam yanıt gösterilen 14. günden sonra kedilerin hiçbirinde kan FCoV RNA pozitif değildi. Aynı zamanda tedavi süresince antikor titreleri önemli ölçüde azalmıştır. FCoV-bulaşmış CRFK hücrelerindeki viral yüklerin hızlı biçimde azalmasını tetikleyen ve aynı zamanda muhteşem efikasite gösteren Xraphconn® içeren GS-441524’ün bulunduğu in vitro verilerini in vivo efikasitesi aynalamaktadır da. Birkaç gün içerisinde önemli ölçüde iyileşen Kedi Enfeksiyöz Peritoniti bulunan kedilerde tüm klinikopatolojik parametreler tipik olarak değişmiştir [37]. Tipik olarak, albumin konsantrasyonu, albumin/globulin oranı, hematokrit ve lenfosit değerleri azaltılırken,total protein, globulin ve bilirubin konsantrasyonları Kedi Enfeksiyöz Peritoniti olan kedilerde yükseltilmiştir [52,53]. Tüm bu değerler Xraphconn® tedavisi ile kısa bir sure içerisinde normal hale getirilmiştir. Vücut ısısı bazı kedilerde yükseltilmiştir, ancak klinikte ilk birkaç günlük süre zarfındaki referans aralığına göre azaltılmıştır. Bununla birlikte, ısı klinikteki ilk günlerle kıyaslandığında kontrol ziyaretleri boyunca genel olarak daha yüksek olması ulaşım esnasındaki stresle açıklanabilecektir. Aynı zamanda, SAA konsantrasyonları önemli ve hızlı biçimde bütün kedilerdeki tedavide azalmıştır. SAA kedilerde bir ana akut faz proteinidir ve şiddetli bir inflamatuar yanıtın varlığını işaret eden Kedi Enfeksiyöz Peritoniti olan kedilerde SAA ifadesinin arttırıldığı gösterilmiştir. Tedaviye yanıt olarak SAA konsantrasyonlarındaki işaretli azalma çok bileşenli ilaç Xraphconn®’un efikasitesini yansıtmaktadır ve Kedi Enfeksiyöz Peritoniti bulunan kedilerde görülen hiperinflamatuar yanıtın dikkate değer sönmesini önermektedir. NMR ve kütle spektrometrisi kullanılarak çok bileşenli ilacın aktif bileşiklerini belirlemek için yapılan yapısal kimya analizi GS-441524’ü Xraphconn®’dan özütlenerek çıkartılan tek adenine C-nükleosid riboz analog olarak tanımlamıştır. Xraphconn®’da ilave aktif maddeler bulunabileceği göz ardı edilememesine ragmen başka benzer nükleosid analoglar bulunmamıştır. Önceden alandaki kedilerde ve deneysel çalışmada GS-441524'ün deri altı uygulaması üzerinde çok olumlu bir gösterilmesine ragmen [25, 28],oral yoldan ilaç verildiğinde 18 kedinin tümünde belirgin biçimde iyileşme görüldüğü için bu çalışma daha yüksek efikasite göstermiştir. Bu olumlu sonuçların birtakım potansiyel nedenleri bulunmaktadır. Birincil olarak, bitkisel preparatlar gibi çoklu bileşen ilaç Xraphconn®’da bulunan GS-441524’e ilave maddeler, sinerjistik etkiler sergileyen bu maddelerin bazıları ile efikasiteyi arttırabilir. Ikincil olarak, yalnızca onaylanmış bir teşhisi bulunan kediler ya da en azından yüksek ihtimalle Kedi Enfeksiyöz Peritoniti tanısı bulunan kediler bu çalışmaya dahil edilmişlerdir, ve bununla birlikte, ve ciddi hastalıkları bulunan kedilerin hatalı bir biçimde tedavi edilmeleri düşük bir ihtimaldi. Üçüncü olarak, bütün kediler semptomatik tedavi olduğu kadar 7/24 yoğun tıbbi tedavi aldılar, özellikle de derinlemesine teşhis prosedürleri ve son derece uzmanlaşmış bir üniversite hastanesinde kişiselleştirilmiş destekleyici tedavi içeren ilk kritik yedi gün boyunca. Bu, ilk kez kontrollü bir çalışmada Kedi Enfeksiyöz Peritoniti bulunan kedilere oral yoldan tedavi (deri altı yerine) olarak uygulandı. Geçmişte, nörolojik Kedi Enfeksiyöz Peritoniti bir kedide bir vaka raporunda oral tedavi başarılı biçimde kullanıldı [26]. Jones ve çalışma arkadaşlarının “kedi enfeksiyöz peritonitinin evdeki tedavisi için ruhsatsız GS-441524-benzeri antiviral terapi etkili olabilir” konulu çalışması (2021)[34] kedilerine denetimli olmayan tedavi kadar bağımsız ve standart olmayan tedavi de sunan özel sahiplerin belgelerinden bulgularını elde eden online bir anket çalışmasıydı. Benzer biçimde, Yin ve çalışma arkadaşlarının “klinik ve laboratuvar özelliklerin geçmişe dönük bir çalışması ve Wuhan, Çin’de kedi enfeksiyözs peritonitis olduğundan son derece şüphelenilen kedilerde tedavi” konulu çalışması (2021) [35] geçmişe dönük bir çalışmaydı ve ileriye yönelik bir bakış açısına sahip değildi. Böylelikle, bu çalışmalar ileriye yönelik değildi ve bu yüzden, karşılaştırılamaz. Oral tedavinin birçok avantajı vardır. GS-441524’ün deri altından enjekte edildiği önceki çalışmalarda, kedilerin yarısından fazlası enjeksiyon bölgesi reaksiyonları geliştirmişlerdir [25]. Böylesi inflamatuar reaksiyonlar FISS gelişimini tetikleyebilir. Buna ilaveten,deri altı enjeksiyonlarının yürütülmesi güç ve kedi sahipleri için zorlayıcıdır ve enjeksiyon reaksiyonlarına sebebiyet veren kedilerde oldukça acılıdır. Bu çalışmada, oral yoldan tedavi edilen 18 kedinin hepsi bütün tedavi süresi boyunca işbirlikçi durdu ve sahipleri başarılı biçimde tabletleri verebildi. Çalışma protokolü her bir katılan kedi için sabit bir doz belirledi (nörolojik/oküler belirtileri olan kediler için 10 mg/kg ve nörolojik/oküler belirtileri olmayan kediler için 5 mg/kg). Kedilere verilen tabletler ve dozlar içerisindeki aktif bileşenin konsantrasyonunu belirleyen prospektüs bu bilgileri ve daha önceden yayınlanan çalışmaları [24,28] temel alıyordu. Bununla birlikte, Xraphconn® tabletlerin içerisindeki tam GS-441524 miktarı bu çalışmada doğrulanmamıştır, fakat bütün kediler gözle görülür biçimde iyileşti, büyük ölçüde olumsuz etkileri bildirilmedi, prospektüste verilen dozun doğru olduğunun varsayılması gerekmektedir. Globulin konsantrasyonları gibi laboratuvar parametrelerine dayanan, bazen de sosyal medya grupları tarafından tavsiye edilen kedilerde kişiselleştirilmiş doz uygulamaları, güncel çalışmada gösterilmedi veya gerekli biçimde görünmedi. Ayrıca, örneğin akciğer koruması için tabletler gibi sosyal medya grupları tarafından tavsiye edildiği gibi her bir kedi için standart hale getirilmiş ilave bir semptomatik tedavi gerekli değildi. Bu çalışma bireysel kedilerin sorunlarına ve ihtiyaçlarına göre semptomatik tedavi uyarlamanın önemini açık biçimde göstermektedir. Yeterli biçimde tanı ve tedavisi olmaksızın, Kedi Enfeksiyöz Peritonitinden bağımsız, önemli sorunlara yol açabilecek, veteriner denetimi olmadan evde sahiplerin kedilerine tedavi uygulayıp uygulamadıklarının belirlenemediği güncel çalışmadaki kedilerden birinde renal mineralizasyon gibi ilgisi olmayan sorunlar meydana gelebilir. Bu yüzden, Kedi Enfeksiyöz Peritoniti tedavisi yalnızca sahiplerin kontrolüne bırakılmamalıdır ve de veteriner hekimliğinde yasal onayı acilen gereklidir. Daha kısa bir tedavi süresinin mümkün ve başarılı olup olmayacağına ve de yüksek maliyetlerin azaltılmasında yardımcı olup olmayacağına zamanla karar verilecektir. Bu çalışmada,tedaviye başlandıktan 14 gün sonrasına kadar hiçbir kedi viremik değildi ve efüzyonlardaki viral seviyeler benzer biçimde azaltılmıştı. Bu sebepten ötürü iyi kontrol edilen bir çalışmada daha kısa bir tedavi süresinin efikasitesini incelemek ilginç olabilir. Iki kedi ciddi biçimde ölümcül durumlarından dolayı çalışmanın dışında tutulmak zorunda bırakılmıştır. Bu çalışmada, yalnızca bir Kedi Enfeksiyöz Peritonitinin teşhisini elde etmek için yapılan yoğun çabalardan sonra kediler dahil edilmişlerdir. Bu durum, yoğun fiziki muayene, temel klinikopatolojik veriler, tanısal görüntüleme ve direkt virus tespit yöntemleri (immunohistokimya ve/veya RT-PCR ile spike geni mutasyon analizi) içeren kişiselleştirilmiş çok adımlı tanısal yaklaşım uygulanarak gerçekleştirilmiştir. Klinik ve patolojik anormaliteler ve görüntüleme bulguları patognomonik olmadığı ve mutasyon analizi olan ya da olmayan RT-PCR ile viral RNA’nın tespitinin Kedi Enfeksiyöz Peritoniti için tanılayıcı olmadığı gerekçesiyle Kedi Enfeksiyöz Peritonitinin teşhisi tek bir tanı testi ile kolaylıkla elde edilememektedir [36]. Bu yüzden, çoklu model tanısal yaklaşım son derece tavsiye edilabilirdir; fakat bu yaklaşım da zaman almaktadır ve bu sırada hastalığın ilerlemesi ciddi hastalığı olan bazı kedilerde tedavinin başarısını engelleyebilmektedir. Buna karşın, maliyet ve viral ilaca direnişin ortaya çıkması dikkate alınarak, amaç hala antiviral tedaviye başlanmadan once bir kedinin gerçekten Kedi Enfeksiyöz Peritonitinden rahatsız olduğundan mümkün olabildiğince emin olmaktır ve tekrardan Kedi Enfeksiyöz Peritoniti tedavisinde veterinerliğin müdahalesinin önemine vurgu yaparak bu durum yalnızca veterinerler tarafından gerçekleştirilebilmektedir. Çalışma süresince tüm kedilerde erişilebilir abdominal ve torasik efüzyonlardaki viral RNA yükleri azaldı ve kan viral RNA yüklerine bakılarak, viral RNA’nın göğüs ve karın bölgelerinden temizlendiği varsayılmaktadır. Xraphconn® tedavisi bu yüzden efüzyonlarda ve kanda viral RNA yüklerini azaltmak açısından faydalıdır ve Kedi Enfeksiyöz Peritoniti olan kedilerde abdominal ve/veya torasik efüzyonları iyileştirmiştir. Bu çalışmadaki Kedi Enfeksiyöz Peritoniti bulunan kedilerin oldukça yüksek bir yüzdelik kesimi (%83) çalışmaya giriş yaparken viral RNA pozitifti. Kedi Enfeksiyöz Peritoniti doğrulanmış kedilerdeki diğer çalışmalarda, kandaki viral RNA’nın tespiti oldukça nadir bir olaydı [53,58-61]. Böylece, Kedi Enfeksiyöz Peritonitinin klinik belirtileri ortaya çıkana dek vireminin genellikle muhtemelen sona ereceği fikri[42], güncel veriler doğrultusunda yeniden ele alınması gerekmektedir. Kedi Enfeksiyöz Peritoniti bulunan çoğu kedi, süre boyunca tüm kedilerde olmasa da çoğunda azalan oldukça yüksek antikor titrelerine sahiplerdir.Bu çalışmada Xraphconn® tedavisi ile ilgili bildirilen olumsuz etkilerin kabul edilebilir olduğu ve ciddi olmadığı düşünülmektedir ve tedavinin kedilerin hiçbirinde kesilmesine gereksinim olmamıştır. Oral uygulamadan dolayı gastrointestinal belirtilere rastlanmamıştır. GS-441524 kullanılan önceki çalışmalarda deri altından enjeksiyona ilişkin olarak başlıca olumsuz etkiler bildirilmiştir (örneğin, ağrı reaksiyonları, yüzeysel cilt lezyonları, cilt ülserasyonu gibi). Klinikte tedavinin ilk günleri süresince hematocrit, total protein ve albuminde bir azalma muhtemelen kan örneğinden dolayı gerçekleşmektedir ve sıvı tedaviden dolayı bir dilüzyonel bir etki olabilmektedir ancak bu durum tamamen geri çevirilebilir. Bu çalışmada görüldüğü en çok söz edilen olumsuz etki 14/18 kedide ortaya çıkan lenfositozdur. Şu zamana dek saha kedilerindeki GS-441524 ile uygulanan tedaviye ilişkin olarak olumsuz etkileri hematolojik parametrelerdeki önemli anormaliteler bildirmemiştir[24-26,28]; fakat deneysel Kedi Enfeksiyöz Peritoniti bulunan kedilerin tedavisinden sonra aynı zamanda lenfosit değerinde göze çarpan bir artış görülmüştür [28]. Lenfositoz çok hassas kedilerde heyecandan ya da antijen uyarılmadan kaynaklı olarak ortaya çıkmış olabilir. Daha küçük kediler genellikle daha yüksek lenfosit değerlerine sahiplerken, çok sözü edilen değişimlerin açıklaması yalnızca yaş olarak küçük olmalarıyla yapılmaktadır. Tedaviye yanıt olarak lenfosit değerlerinde gözlemlenen değişimler özellikle ilgi çekici görünmektedir. Bu çalışmanın amacı konakçı bağışıklık tepkisini detaylı biçimde tanımlamak olmamasına ragmen, SAA konsantrasyonlarının tüm katılan hayvanlarda hızlı ve sürekli bir düşüş gösterirken tedavi başlangıcının akabinde kedilerin >%75 kesiminde hafif dereceden orta dereceye lenfositoz gözlemlenmesi enteresandır. Bir kedide 83. günde (40.7 × 109/L) büyük ölçüde bir lenfositoz ve PARR-temelli klonalite ortaya çıkmıştır ve bu yüzden habis tümör tepkisel bir lenfoid popülasyon önerdi. Bir ölçüde, bu lenfosit tepkiler Bağışıklık Yeniden Yapılandırma İnflamatuar Sendromu’nda (IRIS) görülen klinik özellikleri akıllara getirmektedir [62]. FCoV enfeksiyonu üzerinden monositler tarafından üretilen sitokinlerin hem lenfositlerin azalmasına hem de FCoV enfeksiyonuna karşı bozulmuş bağışıklık tepkisine yol açabileceği tahmin edilebilir. Tümör nekroz faktörü alfa ifadesi [64-68] tarafından uyarılan B ve T hücrelerinin yüksek apoptozu ile ortaya çıkan Kedi Enfeksiyöz Peritoniti bulunan kedilerde negatif prognostik faktör [53] ve lenfopeni yaygın bir özelliktir [53,63]. Sonuç olarak, bağışıklık tepkisindeki bir geri sıçrama sitokin etkisi söndükten sonra meydana gelebilir. Buna bağlı olarak, Kedi Enfeksiyöz Peritoniti olmayan FCoV bulaşmış kedilerin B ve T hücresi hiperplazisi sergilediği [66,69,70] ve dolaşımdaki T hücresi sayılarını arttırdığı gösterilmiştir[63]. Bu nedenle tedavi öncesi ve sonrasında immünolojik özellikleri ve hücresel bağışıklık tepkisini ayrıntılı biçimde tanımlamak özellikle ilgi çekici olacaktır. Eozinofili bu çalışmadaki Xraphconn® tedavisinin bir başka etkisi olarak dikkate alınmaktadır. Çoğu kedide parazit istilası ekarte edildi ve eozinofili gibi belirgin bir neden bulunmamaktaydı. Eozinofil değerleri daha önceki değerlerde özellikle değerlendirmeye alınmamıştır [24,25,28]. Enteresan bir biçimde, eozinofil değerlerinde bir artış COVID-19’dan iyileşen insan hastalarda da bulunmaktadır ve olumlu bir sonuç için belirti olarak öne sürülmüştür [71,73]. Bir kedi tedavinin son gününde hafif derecede Heinz vücut anemisi geliştirmiştir. Heinz cisimcikleri oluşumu hemoglobinin oksidatif zarar görmesinin bir sonucu olarak meydana gelmektedir ve hemolize neden olabilir [74]. Kedilerde, yüksek Heinz cisimcikleri oluşumu propofol [75], asetaminofen [76], propilen glikol [77] gibi birtakım ilaçların ve bileşiklerin verilmesiyle ilişkili olarak daha önceden gösterilmiştir. Hatta, bu kedide Heinz cisimcikleri oluşumu ve Xraphconn®’un tekrarlayan biçimde verilmesi arasında bir ilişkinin olması muhtemel görünmektedir. Daha ayrıntılı çalışmalar olası bir nedensel ilişkiyi açıklığa kavuşturmak için antiviral tedavi sırasında Heinz cisimcikleri oluşumunun miktar ölçümünü içermelidir. Bazı kedilerde, ilk olarak hafif dereceden orta dereceye ilerleyen akciğer enzim aktivitesinde artış dikkate alınmıştır. GS-441524 karaciğerde metabolize edildiğinden, bu metabolizma muhtemelen yüksek karaciğer enzim aktivitesi ile yüksek bir metabolik hıza yol açabilir. Daha önce yayınlanmamış bir gözlemde, karaciğer enzim aktivitesindeki artışlar, bu çok bileşenli bileşik tedavisi ile olumsuz etkiler olarak rapor edilmiştir [78]. Bu çalışmada, aha önce yayınlanmış bir çalışma [25] ile uyumlu olan renal toksisite meydana gelmemiştir. Böbrek fonksiyonu için çok hassas bir parametre olarak kabul edilen simetrik dimetilarginin değerleri tedavi boyunca referans aralığında kaldı. Bir tektorakal ve abdominal efüzyonlu bir kedide muhtemelen Kedi Enfeksiyöz Peritoniti’ne sekonder böbreklerdeki bozulmuş perfüzyon nedeniyle tedavi öncesi 0. günde 18 µmol/L SDMA vardı (referansaralığı 0-18 µmol/L), ancak tedavi başladıktan sonra değerler normale döndü. Başka bir kedide ise renal azotemi vardı ve yüksek SDMA değerleri çalışmaya dahil edilmesinden de önce mevcut bulunmaktaydı. Bu nedenle, çalışmaya giriş yapmadan önce Kedi Enfeksiyöz Peritonitinin yol açtığı renal değişiklikler olduğundan şüphelenmek mantıklıydı. Bununla birlikte, daha ayrıntılı çalışma programında,kedi tedavinin bitiminden sonra büyük olasılıkla üreterolitin neden olduğu üreteral obstrüksiyon şeklinde ilerleyen tek taraflı renal mineralizasyon ve hafif pyelektazi geliştirdi. Çok küçük miktarda asitler geliştirmesinin dışında böbrek hastalığına bağlı olarak açık klinik belirtiler göstermedi. Azoteminin Xraphconn® tedavisine başlanmasından daha önce mevcut olduğu göz önüne alındığında, renal değişikliklerinin olumsuz etkileri temsil etmesi pek olası görünmemekle beraber daha çok ilerleyici böbrek hastalığının Xraphconn® tedavisine alakasız sonucuydu. Önceki bir çalışmada [25], GS-441524 ile tedavi edilen bir kedi, ürede ilerleyici bir artış ve tekrarlanan tedavi raundları sırasında SDMA konsantrasyonunda ani bir artış gösterdi ve önlem olarak tedavinin durdurulmasına karar verildi. Bununla beraber, bu çalışmada idrar spesifik ağırlık ölçümü bildirilmemiştir, bu yüzden renal azoteminin bulunması prerenal azotemiyle kıyasla doğrulanmadı. Ek olarak, üre ve SDMA konsantrasyonları tedavinin kesilmesinden sonra normale döndü [25]. Güncel çalışmadaki aynı çok bileşenli bileşik ile tedavi edilen Kedi Enfeksiyöz Peritoniti olan bir kedinin vaka raporunda belirtildiği gibi, antiviral tedavinin [26] bir sonucu olarak doğrulanmamış olmasına rağmen tedavi esnasındaki yüksek bir SDMA değerinin ilaç kesildikten sonra normaline döndüğü görülmüştür. Şiddetli derecede COVID-19 geçiren insanların tedavisi için kullanılan ruhsatlı Remdesivir Kedi Enfeksiyöz Peritoniti bulunan kedileri tedavi etmek için yayınlanmış çalışmalar henüz mevcut bulunmamasına rağmen Avustralya’da veterinerler tarafından kullanılan Remdesivir sayesinde Kedi Enfeksiyöz Peritoniti bulunan kedilerin tedavisinde faydalı olunabilmektedir. GS-44152 akut COVID-19 geçiren [29,79] hastalarda sınırlı başarıyla kullanılan, nükleosit analoğun bir ön ilacı olan Remdesivir’in ana metabolitidir. Remdesivir’in kabul edilebilir oral biyoelverişlilik bulunmadığından enjeksiyonla uygulanması gerekmektedir. Buna karşın, GS-441524'ün ağızdan alınmasının farelerde COVID-19'a karşı [29,80] etkili olduğu gösterilmiştir. GS-441524'ün remdesivir'e göre bir diğer avantajı sistemik korona virüs enfeksiyonlarının [81] etkili tedavisini sağlamak için doz artışına izin veren azaltılmış karaciğer toksisitesi olması olarak belirmektedir; GS-441524 karaciğer ve akciğer dokusunda aktif nükleosit trifosfata doğrudan dönüştürülür. Mevcut çalışmanın sonuçlarına aynı zamanda daha geniş bir açıdan bakılabilir. COVID-19 salgını durumunda, dünya çapında pediatristler SARS-CoV-2 enfeksiyonu ile ilişkisi bulunan bir sendrom, çocuklardaki yeni bir hastalığı ile karşı karşıya kaldı ve bu durumu çocuklarda multisistem inflamatuar sendrom (MIS-C) olarak adlandırdı. MIS-C ile Kedi Enfeksiyöz Peritonitinin klinik özelliklerini karşılaştırarak, dikkate değer paralellikler bulunabilir [5,6]. Kedi Enfeksiyöz Peritoniti gibi MIS-C ilk olarak çocuklarda görülen hiperinflamatuar bağışıklık tepkisidir [5,6]. Olumsuz anlamda etkilenen çocuklar başlangıçta ise yalnızca sık biçimde gastrointestinal belirtiler göstermektedir. Hastalık sırasında ise kalıcı ateş, asit, plevral ve perikardiyal efüzyon [5,82,83] gibi her biri Kedi Enfeksiyöz Peritoniti bulunan kedilerde de aynı şekilde yaygın olan ileri semptomlar ortaya çıkar. Bu nedenle, Kedi Enfeksiyöz Peritoniti MIS-C’in patogenez ve immünolojisine ve aynı zamanda da daha ileri çalışmalar bekleyen potansiyel tedavi seçeneklerine ilişkin içerikler sunabilir [84]. Son olarak kedilerde Kedi Enfeksiyöz Peritoniti ve tedaviye konakçı tepkisi üzerinde çalışmak çocuklardaki MIS-C’in daha fazla açıklayıcı özellikleri için enteresan biçimde doğal bir model sunabilir. Bu model bu benzer klinik öğelerin patofizyolojisi ve immünolojisi hakkında kritik içerikler sunabilir ve bu da hastalığa ilişkin şiddetli biçimdeki -SARS-CoV-2- için yeni potansiyel tedavi seçeneklerini keşfetmeye yardımcı olabilir. Bu çalışmanın en büyük sınırlaması, tedavi edilmeyen hiçbir kontrol grubunun dahil edilmemesiydi. Bununla beraber, Kedi Enfeksiyöz Peritoniti olan kedileri tedavi edilmemiş biçimde bırakmak için etik nedenler haklı sebep olarak gösterilememektedir ve de sekiz ila dokuz günlük Kedi Enfeksiyöz Peritoniti bulunan kedilerde kısa medyan hayatta kalma süresi açık biçimde gösterilmiştir [9,20]. Böylelikle, tedavi olmadan, çok kısa bir süre çerçevesinde neredeyse tüm kediler ölebilirdi. Diğer bir sınırlama, mevcut çalışmada belirlenmeyen tabletlerin (GS-441524’ten farkl olan) ek bileşenlerinin potansiyel efikasitesi ve diğer bileşenlerin herhangi bir antiviral efikasitesinin ölçümü başarılı biçimde belirlenip saflaştırıldığında gelecekte ilginç bir ilave yaklaşım olabilir. Tedavinin oral uygulamasından dolayı, ölümcül durumdaki kediler çalışmaya dahil edilmemiştir. İki kedi ciddi biçimde ölümcül bir son aşama durumunda çalışmanın dışında tutuldular. Böylesi bir durumda, düşük metabolizma oranı ve oral ilaçların büyük ihtimalle inaktif bağırsak yolundan zar zor emilmesi gerçeğinden hareketle oral yoldan alınan bir ilaç muhtemelen hiçbir etki göstermeyecektir. Bundan dolayı, çalışmaya kediler dahil edilmedi ve insani nedenlerden ötürü ötenazi uygulandı. Ayrıca, mevcut çalışmanın küçük bir örnek boyutu ek bir sınırlamadır. 5. Sonuçlar Sonuç olarak, bu çalışma bu trajik ve ölümcül hastalığa sahip kedilerin oral yoldan tedavi ile iyileştirilebileceğini açıklıkla gösteren ilk geleceğe yönelik tedavi denemesidir. Maalesef ki, veteriner olmayan kişilerin ve sosyal medya gruplarının yargısına dayanarak iyi niyetli kedi sahiplerini kedilerini kendi kendine teşhis etmeye ve tedavi etmeye zorlarken bu ilaç şu anda birçok ülkede veteriner kullanımı için yasal olarak mevcut değildir. Böylece, Kedi Enfeksiyöz Peritonitinden muzdarip kedilere denetimli bir tedavi sunmak için veteriner uzmanlar tarafından yasal olarak kullanılabilmesi için ilacın hızlı bir biçimde ruhsatlanması için çalışacak ilgili resmi kurumlara ve endüstriye acil bir ihtiyaç vardır. Ek Materyaller: Devamı internette https://www.mdpi.com/article/10.3390/v13112228/s1, Dosya S1: Xraphconn® Prospektüsü’nde mevcuttur (A) ilk grubun prospektüsü. (B) İkinci grubun prospektüsü. Tablo S1: Tüm kedilerde uygulanan muayenelerin programı (muayenelerin yer aldığı günler gri ile işaretlenmektedir). FCoV kedi koronavirüsü, ultrason ve parasentez: abdominal veya torasik efüzyon varsa, ek karın ultrasonu(ve/veya toraks) sıvı miktarını değerlendirmek ve sıvı örnekleri elde etmek için 0. günden 7. güne kadar günlük olarak yapıldı; efüzyon olduğu sürece ek olarak efüzyon viral yükü belirlendi. 2 simetrik dimetilarginin (SDMA) ve serum amiloid A (SAA) dahil. Tablo 2: Hartmann ve Kuffer (1998) tarafından kedilerin genel durum ve sağlığını değerlendirmek için modifiye edilmiş Karnofsky skoru [40]. Metin S1: Xraphconn®’daki aktif maddenin tanımlanması. Tablo S3: Tamamen döteryumlu dimetil sülfoksit (DMSO-d6) içinde saf GS-441524 üzerinde rapor edilen verilerle karşılaştırılarak Xraphconn®’dan çıkartılan nükleosit analog için ppmdeki 1H ve 13C kimyasal değişiklikler. numarası rapor edilmemiş; proton sinyallerinin bölme kalıpları (s, tekli; d, ikili; t, üçlü; q, dörtlü; dd, ikili ikili;app q, görünür dörtlü). Şekil S1: Çalışma programı sırasındaki efüzyonlu kedilerin yüzdelikleri. Çubuklar her bir muayene günündeki efüzyonlu kedilerin yüzdeliğini temsil etmektedir. Gri bölgeler efüzyonun bulunduğu fakat parasentezin mevcut bulunmadığı kedi oranını temsil eder. Yeşil bölgeler efüzyonun elde edilebildiği fakat kedi koronavirüsünün (FCoV) RNA-negatif olduğu kedi oranını temsil eder. Turuncu bölgeler efüzyonun elde edilebildiği ve RNA’nın pozitif olduğu kedi oranını temsil eder. Şekil S2: Çalışma programı süresince anti-kedi koronavirüsü (FCoV) antikor titreleri. Antikor titresinin tahmini değerlerini ve %95 güven aralıklarını gösteren şekil. f 1:25, 1:100, 1:400, 1:1600 ve 1:6400’lük dilüzyonlarda test edilen örnekler. Kırmızı yıldızlar dayanıklı bir doğrusal olan karışık etki modeli ile ölçümü yapılan 0. günle (tedavi öncesi) kıyaslandığında tedavinin farklı günlerindeki parametrelerin farkına (p ≤ 0.05) işaret etmektedir. Yazar Katkıları: Kavramsallaştırma, K.H., U.v.B., M.A., K.M. ve R.H.-L.; Metodoloji, D.K.,K.Z., R.H.-L., M.L.M., A.M.S., J.H., S.W., C.M.H. ve E.L.; Validasyon, D.K., K.Z., Y.Z., S.F., R.D.ve M.B.; Biçimsel analiz, Y.Z., D.K., K.Z., S.F. ve M.B.; Soruşturma, D.K., K.Z., M.B., S.F., R.D.,M.L.M., A.M.S., J.H., S.W., C.M.H. ve E.L.; Kaynaklar, K.H., U.v.B., R.H.-L., K.M., M.H.G., E.L. veB.K.; Yazma—orijinal taslak, D.K., K.Z. ve K.H.; Yazma—inceleme ve düzenleme, U.v.B., K.H., M.A.,K.M., R.H.-L., S.F., M.B., R.D., L.K., M.L.M., A.M.S., J.H., S.W., C.M.H., M.H.G., Y.Z., E.L. ve B.K.;Görselleştirme, Y.Z., R.H.-L., M.L.M., A.M.S., J.H. ve S.W.; Denetim, K.H. ve U.v.B.; projeuygulama, K.H., U.v.B., M.A., K.M., R.H.-L., M.H.G., E.L. ve B.K.; Finansman alımı, K.H.ve U.v.B. Tüm yazarlar, makalenin yayınlanan versiyonunu okudu ve kabul etti. Finansman: Bu çalışma herhangi bir dış finansman almamıştır. Kurumsal İnceleme Kurulu Açıklaması: Kedilerdeki ileriye dönük çalışma, yazılı bilgilendirilmiş sahip onayı ile ileriye dönük çalışmalar için Alman yönergelerini karşıladı ve Yukarı Bavyera Hükümeti, referans numarası 55.2-2532.Vet_02-20-52 ve etik komite tarafından onaylandı. (referans numarası 261-19-03-2021) Münih LMU Klinik Veterinerlik Merkezi. Bilgilendirilmiş Onam Beyanı: Uygulanamaz. Veri Kullanılabilirlik Beyanı: Yazarlar, makul talep üzerine ilgili yazardan çalışma sırasında analiz edilen veri kümelerini temin edilebileceğini onaylamaktadır. Teşekkür: Oral çok bileşenli ilaç Xraphconn®, Mutian Life Sciences Limited tarafından memnuniyetle sunulmuştur. Yazarlar üstün teknik yardımlarından dolayı Zürich Üniversitesi’nden Eva Bönzli, Julia Klaus, Martina Stirn, Guy Schepers ve Evelyn Kuhlmeier’e teşekkür etmektedir. RT-PCR ve antikor ölçümü Zürih Üniversitesi Vetsuisse Fakültesi'nde Klinik Çalışmalar Merkezinin lojistiği kullanılarak kısmi olarak uygulandı. Yazarlar aynı zamanda çok değerli bilimsel bilgilerinden dolayı Jan Balzarini’ye de teşekkürlerini sunmaktadır. Çıkar Çatışması: Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bulunmadığını beyan etmektedirler. Oral çok bileşenli ilaç Xraphconn®, Mutian Life Sciences Limited tarafından sunulmuştur ancak Mutian çalışma verilerinin yorumlanmasında veya makaleyi yayına gönderme kararında hiçbir rol oynamamıştır. Bilgiler yalnızca bilimsel yayın amaçlı olduğu için hiçbir ticari çıkar çatışması bulunmamaktadır.
SOSYAL MEDYA
ADA VETERİNER POLİKLİNİĞİ Levent Mah. Sülün Sk. No:14 1. Levent - Beşiktaş / İstanbul Tel : 0212 324 67 32 Tel : 0212 324 67 33 Gsm: 0530 403 55 05 E-posta: [email protected] Web: www.adaveteriner.com Haftanın her günü, 09.00-22.00 saatleri arasında hizmet veriyoruz.
Bu site Neta Website altyapısı ile hazırlanmıştır.
Daha iyi hizmet sunabilmek için web sitemizde çerezler kullanılmaktadır. Web sitemizi kullanarak çerezleri kabul etmiş sayılırsınız.
WhatsApp Destek